Clonagem de Genes:
 

• É um método mais complexo de isolamento e amplificação de DNA que a PCR, mas muito útil em certas situações.
• Envolve a utilização de endonucleases de restrição, a criação de mapas de restrição e a utilização de vetores para a recombinação e clonagem do gene em estudo.
• Em etapas:

• As Endonucleases de Restrição:
 

• Fazem a clivagem da molécula do DNA em seqüências específicas da molécula, geralmente palindrômicas. Ex:  -GAATTC-
          -CTTAAG-
• As endonucleases de restrição são batizadas a partir do nome do microorganismo do qual foram isoladas, com a indicação da seqüência de descoberta.
• Exs:                    

1. TaqI - Termus aquaticus
2. HaeIII - Haemofilus aegiptius

• Algumas endonucleases de restrição criam extremidades irregulares e, portanto, coesivas; outras geram extremidades "cegas".
• Ex: TaqI: 4 bases, extremidades adesivas:

• A Criação do DNA Recombinante:
 

• Envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase.
• A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da DNA ligase
• Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em uma molécula maior, que passa a ser recombinante.
• Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito várias vezes.
 

• Os Vetores:
 

• Um vetor é uma molécula de DNA à qual o fragmento de DNA a ser clonado está ligado
• Os principais vetores utilizados são plasmídeos, e vírus de animais
• Os plasmídeos são os mais utilizados para a clonagem de pequenos fragmentos de DNA; são geralmente obtidos a partir de células bacterianas, facilmente reintroduzidos nestas células e possuem capacidade autônoma de replicação.
• Um exemplo amplamente utilizado de plasmídeo é o pBR322, que possui os genes de resistência à tetraciclina e à ampicilina.
• Alguns tipos de vírus, como o bacteriófago l , são utilizados na clonagem de fragmentos maiores de DNA
• Os Cosmídeos são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA

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