SAMPL (Selective Amplification of Microsatellite Polimorphic Loci)

Considerações Gerais - Trata-se de uma versão multiplex do ensaio SSR, combinada a alguns passos da técnica de AFLP. A amplificação seletiva de locos polimórficos microsatélite (SAMPL) combina a capacidade multiplex de AFLP com a capacidade de discriminação alélica de SSR, em uma única reação (Vogel et al, 1994). Esta técnica ainda está em pleno desenvolvimento e atravessa testes preliminares em diferentes organismos, mas os dados acumulados até agora sugerem um grande potencial para a análise de diversidade genética. A técnica baseia-se na substituição de um dos primers usados na técnica AFLP (homólogo ao adaptador) por primer homólogo a uma sequência repetitiva. Desta forma, a amplificação via PCR se dará entre a sequência repetitiva e o primer homólogo ao adaptador, detectando polimorfismo existente dentro da sequência repetiva. No momento, SAMPL tem sido prioritariamente utilizado para amostrar polimorfismo em locos de sequências repetivas compostas (ex. (CA)10(AT)8). A razão básica para isto é técnica: em geral observa-se que se não for feito um "ancoramento" do primer dentro da sequência repetiva, perde-se resolução nas bandas (Julie Vogel, comunicação pessoal). O ancoramento, que contorna este problema, baseia-se na utilização de um primer que seja ao mesmo tempo homólogo às duas sequências repetitivas que compõem um loco microsatélite composto (ex. primer (CA)2(AT)3 para a sequência descrita acima). A maior parte dos locos SAMPL amostrados são co-dominantes.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - SAMPL une o potencial de detecção de polimorfismo, característico de marcador SSR, com a capacidade multiplex da técnica AFLP. É, portanto, uma técnica de alto conteúdo informativo (Figura 1). O número de locos acessados (capacidade multiplex) é alto e o polimorfismo detectado em cada reação é superior ao observado com AFLP. O número de alelos detectados por locos é alto, variando em relação a SSR somente no que tange às peculiaridades de sequências compostas em relação a sequências únicas. Tanto o custo de implementação da técnica como a demanda em trabalho assemelham-se à técnica SSR (Figura 2), ou seja, não se trata de uma técnica imediatamente acessível. Uma vez obtidos os primers informativos, no entanto, o ensaio SAMPL torna-se rápido, e os custos caem significativamente, incrementando substancialmente a acessibilidade da técnica. Os resultados obtidos com SAMPL até o momento limitam-se a poucas espécies, mas apontam para grande eficência e utilidade em estudos genéticos.

Técnicas baseadas em restrição e hibridização de sequências de DNA

O desenvolvimento de técnicas baseadas na hibridização de sequências de DNA abriu novas opções para o estudo de variações na fita de ácido deoxiribonucléico já no final da década de 70 e início dos anos 80. A descoberta de enzimas de restrição, a possibilidade de transferência de fragmentos de DNA para membranas permitindo a reutilização dos fragmentos de DNA de um gel de eletroforese em outros ensaios (Southern, 1975), e o desenvolvimento de novos métodos de marcação radioativa e luminescente para fins de hibridização de fragmentos de DNA determinaram o emprego eficiente de RFLP em análise genética. A posterior identificação de sequências repetitivas de DNA de comprimento longo (minisatélites) e a utilização destas sequências como sondas em análise genômica possibilitou o desenvolvimento de uma nova classe de marcadores adequados à análise de fingerprinting de DNA.

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