RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Considerações Gerais - O polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP), obtido através do tratamento do DNA com enzima de restrição, é observado através de uma sequência de passos que tornam a técnica robusta, mas ao mesmo tempo trabalhosa. A análise de RFLP em genoma cloroplástico é mais simples visto ser este genoma bem menor que o nuclear. Neste caso, o ensaio RFLP consiste na obtenção de cpDNA e tratamento do mesmo com enzima de restrição, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos de acordo com o seu comprimento (tamanho). Por ser circular, o número de fragmentos obtidos do cpDNA corresponde ao número de sítios de restrição reconhecidos pela enzima neste genoma. O genoma nuclear, por outro lado, é muitas vezes maior e mais complexo que o genoma cloroplástico. Assim sendo, o simples corte com enzima de restrição seguido de eletroforese não permite a identificação de fragmentos únicos, mas a observação de um arrasto no gel, devido à presença de milhares de fragmentos de diferentes tamanhos na matriz de eletroforese. Desta forma, duas outras etapas são necessárias para se observar polimorfismo: a obtenção e seleção de clones de DNA e a hibridização destes clones com fragmentos homólogos do genoma, fragmentado e fixado em membranas de nylon. Sucintamente, em se tratando de espécies onde pouca ou nenhuma informação genética é disponível, a obtenção de clones de DNA é feita através da construção de bibliotecas (genômicas ou de cDNA) e seleção de clones informativos para o estudo que se planeja desenvolver. Com exceção de algumas poucas espécies onde extensos mapas genéticos e um grande número de clones são disponíveis (ex. milho, arroz, soja, etc.), regra geral faz-se necessário a construção de bibliotecas de clones e laboriosa seleção de clones informativos antes de se iniciar um estudo com RFLP. Isto é particularmente característico de espécies tropicais agrícolas e florestais, onde o conhecimento genético é incipiente. A seleção de clones informativos em geral baseia-se na escolha de clones de cópia única, isto é, de clones de sequência homóloga a segmentos de um único loco no genoma. Isto facilita sobremaneira os estudos de segregação Mendeliana para a construção de mapas genéticos, em espécies diplóides e em poliplóides. Selecionados os clones informativos, o próximo passo da técnica envolve a marcação do clone (radioativa ou luminescente) e hibridização com o DNA clivado e desnaturado, fixado após a eletroforese em uma membrana (Southern, 1975). A exposição da membrana a filme de raio-X após a hibridização com sondas marcadas leva à sensibilização do filme no ponto em que a sonda hibridiza com fragmento homólogo, formando uma banda na autoradiografia. Marcadores RFLP são em geral co- dominantes, isto é, permitem a identificação de alelos maternais e paternais em indivíduos heterozigotos.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - Marcadores RFLP de cópia única possuem, por definição uma baixa capacidade multiplex (Figura 1). É possível hibridizar duas ou mais sondas em regiões distintas de uma membrana, incrementando o número de locos amostrados em cada ensaio, mas isto não é normalmente feito em larga escala. O número médio de alelos RFLP identificados por loco varia de acordo com a estrutura genômica da espécie estudada, mas não é tão alto como SSR. A proporção de locos polimórficos em um ensaio RFLP também não é alta. Em espécies autógamas, por exemplo, um bom número de locos RFLP devem ser analisados até que polimorfismo seja encontrado. A técnica RFLP, por se basear em homologia de sequência, é uma técnica bastante robusta, adequada a estudos a nível intraespecífico, interespecífico e mesmo intergenérico. Contudo, trata-se de uma técnica trabalhosa, de custo elevado e morosa para a obtenção de dados, ou seja, de baixa acessibilidade (Figura 2).

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