Técnicas de uso corrente na avaliação da diversidade genética

Considerações Gerais - Para certos tipos de análise, a reação de PCR específica apresenta um grande fator limitante: o seu uso em larga escala (ex., vários locos) requer o conhecimento dos nucleotídeos que compõem as duas extremidades da sequência de DNA que se deseja amplificar. Com base neste conhecimento é que o par de primers que flanqueiam uma região-alvo no DNA pode ser sintetizado e utilizado na amplificação desta sequência através da reação da polimerase em cadeia. No início da década de 90 dois grupos apresentaram uma variação da técnica de PCR que foi denominada de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Williams et al., 1990) ou AP-PCR (Amplified Polymorphism - Polymerase Chain Reaction, Welsh & McClelland, 1990). Esta variação foi desenhada para contornar o problema do conhecimento prévio da sequência de DNA que se deseja amplificar, possibilitando a utilização da técnica em organismos onde nenhum conhecimento de sequência de DNA existia (praticamente a maioria esmagadora dos organismos). A modificação baseia-se na utilização de apenas um primer (decâmero) na reação de PCR, alterando também as condições específicas de amplificação da reação, além do desenho do próprio primer. Esta variação possibilita que ocorra amplificação ao acaso de segmentos de DNA no genoma. A amplificação é função da probabilidade de, após a desnaturação da fita dupla de DNA, existir no genoma uma sequência complementar ao primer em uma das fitas e, a uma distância que possa ser percorrida pela polimerase, uma outra sequência complementar ao primer na fita oposta. Portanto, a reação de RAPD ocorre devido ao anelamento do primer único em pontos próximos do genoma, delimitando a região que será amplificada(Williams et al., 1990; Welsh & McClelland, 1990).

É intuitiva a noção de que o número de bandas observadas é função da própria complexidade do genoma analisado. O polimorfismo detectado em um loco RAPD refere-se, em última análise, a mutações que ocorrem na fita de DNA impedindo o anelamento do primer a intervalos de fita que permitam a amplificação do segmento pela polimerase. Como resultado, nos locos onde a reação de PCR ocorre em progressão geométrica o segmento de DNA é amplificado e observado em gel de eletroforese. A reação de PCR pode não ocorrer, por outro lado, devido ao não anelamento do primer com o DNA. O resultado é a ausência de bandas em gel de eletroforese para um indivíduo homozigoto naquele loco. Outras causas de polimorfismo em loco RAPD são, por exemplo, inserções ou deleções de sequências. Marcadores RAPD são tipicamente dominantes, isto é, o fenótipo eletroforético de um indivíduo heterozigoto para um determinado loco não é geralmente distinguido de um indivíduo homozigoto para o alelo amplificado. Estas qualidade, naturalmente, pode limitar a utilização de RAPDs para certos tipos de análise.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - A análise conjunta da capacidade multiplex, capacidade de identificação de alelos e proporção de locos polimórficos por reação permite comparar as diferentes técnicas moleculares em relação à sua eficiência para análise de variabilidade genética (Figura 1). Marcadores RAPD em geral apresentam um bom conteúdo informativo, isto é, possuem uma boa capacidade multiplex (amostram o genoma em vários locos ao mesmo tempo), identificam um bom número de locos polimórficos por reação, embora discriminem um baixo número de alelos por loco (dois alelos, amplificado e não-amplificado) (Figura 1). Alia-se a isto o fato de ser uma técnica altamente acessível, por ser rápida, de baixo custo e pouco intensiva em mão-de- obra (Figura 2). Esta alta acessibilidade confere à técnica uma boa aceitação para análises relacionadas à: (a) diferenciação de linhagens, (b) estimativa de variabilidade em Bancos de Germoplasma, (b) estudo de estrutura genética de populações, (d) estimativa de parâmetros genéticos, (e) estudos de duplicação de acessos em Bancos de Germoplasma, (f) análise de paternidade, etc. É importante salientar que a técnica de RAPD democratizou sobremaneira a utilização de marcadores moleculares em análise genética, particularmente no âmbito da análise de variação genética. Apeser de ter sido desenvolvida recentemente, já são inúmeros os trabalhos que analisam e estimam diversidade genética de diferentes espécies animais e vegetais utilizando a técnica.

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