DNA & Cromossomos
Shotgun Sequencing of the
Human Genome
J. Craig Venter, Mark D. Adams, Granger G.
Sutton, Anthony R. Kerlavage, Hamilton O. Smith
and Michael Hunkapiller
Em julho de 1998 Craig Venter da TIGR publicou um artigo na Science procurando parceiros para sequenciar o genoma Humano.
Ele afirmou que o Human Genome Project (PGH)que foi criado em 1 de outubro de 1990 tinha como meta sequenciar todo o genoma Humano em 15 anos, e
a meta era de ter todo o genoma Humano sequenciado e de vários oaganismos modelos. E com as inovações tecnologicas como os BAC ( Bacterial Artificial Chromosome)
E estas inovações tecnologicas vão acerelar o processo de sequenciamento diminuindo os custos. Um exemplo foi a invensão do 1º applied biosystens em 1997 e da Taq cycle sequencing em 1990.
Modelos mais modernos de sequenciadores foram criados para um numero maior de amostras e usando corantes com maior fluorescencia e Taq engenheirada para sequenciamento. Estes fatores aumentou a produtividade e diminuiu os custos e aumentou a confiabilidade.
O primeiro genoma concluido o do haemophilis influenzae já foi o do "SHOTGUN"(sequenciamento aliatorio)e também mais 8 genomas também usaram o sequenciamento aleatório mesmo genoma com auto concentrações de GC (65%) e AT (82%).
A estrategia do PGH era fazer o mapas e após o mapas prontos sequenciava centenas de Kbp, e cromossomos inteiros. Um Exemplo em 1997 só 120Mbp ( previsão de 200Mbp para 1998 )A vantagem e da alta confiabilidade, e o pior e existem regiões dificio de sequenciar e necessidade de subclonar e dificudade de preencher falhas.
Em 1998 a Perkin-Elmer lançou o ABI PRISM 3700, este sequenciador é de capilar capaz de sequenciar mil amostras por dia e necessário apenas 15 minutos de operação por dia, contra 8 horas no ABI PRISM 377S. Este novo sequenciador é mais sensível e possibilitou automação das reações químicas e purificação do DNA. Isto possibilitou fazer 10 milhões de reaçãoes de sequenciamento num tempo bem menor. A TIGR e a Perkin-Elmer formaram um consórcio para formar a CELERA com a intenção de em 3 anos sequenciar todo o genoma humano com o custo de 200 milh~does de dólares, usando a técnica de SHOTGUN e estva à procura de parceiros comerciais visando lucro.
A técnica de SHOTGUN se baseia na quebra aleatória do DNA e clonando em vetores. Serão sequenciadas 7 milhões sequencias que equivalem a 35 bilhões de pares de bases que equivalem 10 vezes a cobertura do genoma humano.Serão clonados mil insertos em puc18 com insertos de 2 kbp e nesses clones serão sequenciados 500 pares de bases em cada extremidade. Em 100 plasmídeos X com insertos de 10 kbp. E em 10 BACs contendo cada um 150 kbp.
Essas sequencias depois são montadas usando o programa TIGR Assembler. Em 1997, várias sequencias de extremidades de BACs já estavam disponíveis. Em 1998, a TIGR e a Washu já tinham sequenciado 300 mil extremidades de BACs (500 pb).
Metas: sequenciar 30 milhões de PUC18, 5 milhões de plasmídeos X e 300 mil BACs a Washu e a TIGR vão fazer.Com esses clones vai se percorrer o genoma humano 46 vezes e o sequenciamento das extremidades cobre o genoma 10 vezes.
Vão ser usados 230 sequenciadores,gerando-se mil sequencias por dia cada um. Se vai ter que se sequenciar 70 milhões de sequencias, serão necessários 304 dias e cada sequenciador vai necessitar de 115 mil moldes por dia. Esse sequenciamento vai cobrir o genoma humano 9 vezes e com isso pode-se saber a posição de todos os clones.
Alem disso já se sabe que o BAC XYZ é do clomosso 13. E sequenciou STS do cromosso 3. e 300000 STS já disponiveis usando como marcadores 1 STS a cada 100 Kb. ESTs = seq. parcial de cDNA, cobrem 5Mbp do genoma.
Planos
Em 3 anos 99,9 % do genoma sequenciado, Com cobertura de 10 vezes com precisão de 1 erro a cada 10000Pb
Business:
1- contratar de sequenciamento em larga escala.
2- descoberta gênica
3- Serviço de banco de dados
4- Análises de polimorfimos ( espera-se 100000 SNPs )
Resultados
Propiedade de sequencias de DNA ( promotores, repetições, comparação com outras especies e polimorfimos e de proteínas deduzidas )
PLANOS
Compensação finaceira para firmas Farmacêuticas
Deposito das sequencias no NCBI
Patentes
Não do sequenciamento, mas de proteínas deduzidas com função descoberta ( espectativa 100-300 novos genes interessantes )
Vai funcionar?
Durante a construção do centro vai se completar o genoma de Drosophila pelo método de SHOTGUN, já se tem 12% do genoma com qualidade "GOLD"
Estatisticas de genomas concluídos.
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