PROTOCOLO PREPARAÇÃO DE BACTÉRIAS ELETROCOMPETENTES
1. Peque uma única colônia da bactéria desejada e a inocule em 25 ml de 2xYT;
levar ao shaker pela noite à 37ºC.
2. Tome 2,5 ml desta cultura e a inocule em 250 ml de 2xYT (sem antibióticos). Cresça
até OD600 = 0,2 - 0,25 (certifique-se de não exceder a este limite!!!).
3. Tão logo que o OD desejado seja alcançado, o frasco contendo a cultura deve
ser esfriado no gelo. Uma vez frio, o volume da cultura é dividido em 8
garrafas, cada uma com 32 ml (usar garrafas de 40 ml).
4. Centrifugar as células a 10.000 rpm por 10 minutos num rotor SS-34
(centrífuga Sorvall) a 4 ºC.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 8ml de glicerol 10%
frio e estéril (mantê-lo no gelo por todo o tempo). Juntar em 2 tubos (32 ml
cada). O sobrenadante deve ser descartado imediatamente para evitar perda de
células.
6. Centrifugar por 15 minutos a 10.000 rpm e a 4ºC.
7. Despejar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 35ml de glicerol 10%
frio e estéril.
8. Centrifugar por 15 minutos a 10.000 rpm e a 4ºC.
9. Despejar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 15 ml de glicerol 10%
frio e estéril. Juntar em um tubo.
10. Centrifugar por 20 minutos a 10.000 rpm e a 4ºC.
11. Despejar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de glicerol 10% frio. Tomar
25 ul da suspensão e adicionar a 10 ml de glicerol 10%. Determinar o OD600.
Continue adicionando glicerol 10% à suspensão até o OD600 das células diluídas
(25 ul em 10 ml) seja igual à 0.15.
12. Separar as células (alíquotas de 40 ul) e congelar rápido em gelo
seco/etanol (não use nitrogênio líquido). Estoque a - 70ºC.