REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO BÁSICA PARA PRODUTOS DE PCR

Previamente deve-se purificar o produto de PCR utilizando Kit ou o protocolo EXO/SAP. A reação deve conter por tubo os seguintes componentes:

ET kit: 3 ul

Primer F ou R (10uM): 0.5 uL (0,5 uM)

DNA: aproximadamente 100 ng de produto de PCR purificado (cerca de 2 uL).

Completar com água milli-Q estéril até o volume final de 10 ul.

O programa utilizado para reação deve levar em conta a temperatura de anelamento do primer, temos o exemplo do programa utilizado no PROJETO GENOMA:

1. Programa: Megaseq

30 ciclos de: 95^oC, 2 sec

95^oC 20 sec

50^oC, 15 sec

60^oC 1 min

20 ^oC para sempre.

Após a reação deve-se precipitar as amostras, adicionando à placa de sequenciamento antes da precipitação, ou precipitando separadamente em microtubos.