PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS EM MICROPLACAS (96-well)

 

Crescimento

A partir da placa de petri utilizando replicador:

 

1.      Encher cada poço de uma microplaca  de 96 poços com 1,2 mL de meio Circle Grow ou terrific broth contendo 1 µL/mL de Ampicilina ( 50 µL de ampicilina 100 mg/mL para 50 mL de meio).

 

2.      Inocular colônias individuais com o auxílio de palitos de dente ou com replicador. Selar a placa com adesivo. Fazer dois furos pequenos em cima de cada poço, com uma agulha, para facilitar a aeração. (aquecer a ponta da agulha no fogo ajuda a furar e elimina riscos de contaminação)

 

 

3.      Se necessário, fazer cultura permanente em placas estéreis (120 µL de meio). Crescer da mesma forma que a deep well.

 

Para limpar o replicador durante o procedimento:

 

-          Após a inoculação, lavar em água destilada (placa deep well) e pressionar em papel absorvente para tirar os restos de células que ficam nas pontas do replicador.

-          Passar o replicador em uma banheira com etanol e flambar bem.

-          Esperar esfriar e replicar de novo.

 

4.      Incubar a 37ºC, 250 rpm, por 22 horas (esse período de crescimento e crítico para o rendimento adequado de DNA)

 

 

 

A partir das placas réplicas (fundo em U congeladas):

 

1.      Encher cada poço de uma microplaca  de 96 poços com 1 mL de meio Circle Grow ou terrific broth contendo 1 µL/mL de Ampicilina ( 50 µL de ampicilina 100 mg/mL para 50 mL de meio).

2.      Deixar a placa descongelar. Para crescimento de alguns clones da placa, o ideal é não deixar a placa descongelar, raspar a cultura com ponteira e inocular no meio.

3.      Pipetar 30 uL de cultura da placa réplica para a placa deep well já com o meio.

4.      Colocar para crescer da mesma forma descrita no procedimento anterior.

5.      Após 22-24 hs, aliquotar 100 uL para uma nova placa réplica fundo em U. Acrescentar 100 uL de glicerol 50% autoclavado, tampar bem e inverter a placa para misturar bem. Estocar a –70c.

6.      Seguir o protocolo de  mini prep normalmente.

 

 

Mini-Prep

 

1.      Marcar a placa com fita crepe contendo: nome, n.º da placa e biblioteca. Selar a placa com adesivo.

 

2.      Centrifugar a microplaca por 6 min., 4000 rpm, para sedimentar as células. (caso a centrifuga disponível não chegue a essa velocidade aumentar o tempo de centrifugação, mas cuidado para não empacotar demais as células ou lisa-las durante a centrifugação)

 

3.      Remover o adesivo, descartar o sobrenadante, inverter a placa sobre papel absorvente por 5 min e selar a placa. Depois disto pode ser mantida a –20ºC. Ideal  processá-las no mesmo dia.

 

4. Ligar a estufa a 90ºC. Separar e identificar o material a ser utilizado ( 1 placa fundo redondo, 1 placa fundo V e 1 placa filtro ).

 

5. Adicionar a cada poço 240 µL de GET, selar a placa com adesivo  e agitar (Vortex) por 2 min, para ressuspender bem as células.

 

6. Centrifugar no mínimo 9 min., 4000 rpm, até sedimentar as células.

 

7. Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante. Deixar a placa invertida em papel absorvente por 5 min.

 

8. Adicionar a cada poço 80 µL de GET com RNAase (2 uL do estoque de (10mg/mL)), selar  placa com adesivo e agitar ( Vortex ) por 2 min, para ressuspender as células.

 

Para duas placas: 16 ml de GET + 400 uL de RNAase

 

10. Transferir toda a suspensão de células para a microplaca de 250 µL de polipropileno de fundo redondo (tipo Elisa), já contendo a RNAse.

 

11. Adicionar a cada poço 80 µL de NaOH 0,2N / SDS 1% (Preparar 20 mL para 2 placas iguais na hora de usar, essa solução não pode ser estocada). 

1 mL NaOH 4M + 2 mL SDS 10% + água MilliQ q.s.p. 20 mL (solução para 2 placas).

OBS.: Não pode ser adicionada uma solução de NaOH após SDS 10% , use água como intermediário. Se a solução precipitar, deixe um pouco em banho-maria 37c.

 

12. Selar bem a placa com adesivo e misturar 30 vezes por inversão.

OBS: Aproveitar a tampa da placa com filtro para pressionar a placa com a suspensão antes da inversão.

 

13. Incubar por 10 min em temperatura ambiente. Centrifugar por alguns segundos até que não fique solução no adesivo

 

14. Adicionar a cada poço 80 µL de KOAc 3M (acetato de potássio – estocado a 4ºC). Selar a placa com adesivo  e misturar 30 vezes por inversão

 

15. Incubar por 10 min em temperatura ambiente. Pulsar até chegar a 4000 rpm.

 

16. Remover o adesivo e incubar a placa aberta  em estufa a 90ºC por EXATOS 30 min.

 

17. Selar a placa e esfriar em gelo picado por 10 min. Centrifugar por 9 min., 4000 rpm, 20ºC

 

18. Fixar com fita adesiva, uma placa Millipore (MAGV N22) no topo de uma microplaca de fundo em “V” de 250 µL de polipropileno. Verificar se os poços estão alinhados.

 

19. Transferir todo o volume do sobrenadante (evitando transferir os debris celulares) para a placa Millipore e centrifugar (sem a a tampa) por 6 min., 4000 rpm, 20ºC ou até todo o volume descer para a outra placa (fundo em “V”).

OBS: Caso centrifugada por muito mais de 5’ 30’’ a 4000rpm a placa Millipore corre o risco de rachar.

 

20. Remover e descartar a placa Millipore. Adicionar 100 µL de Isopropanol (Merck) ao filtrado.

 

21. Selar bem a placa com adesivo (resistente a  alcool) e misturar 30 vezes por inversão.

 

22. Centrifugar por 45 min, 4000 rpm, 20ºC.

 

23. Retirar o adesivo e descartar o sobrenadante (invertendo a placa) 

 

24. Adicione 200 µL de Etanol 70% gelado.

 

25. Centrifugar por 5 min, 4000 rpm a 20ºC. Remova o sobrenadante.

 

26. Inverter a placa sobre papel absorvente e pulsar, 900 rpm, 20ºC.

 

27. Deixar a placa secar em temperatura ambiente por 60 min, coberta com papel toalha.

 

28. Ressuspender o DNA com 60 µL  de água MilliQ, cobrir com adesivo, anotar dados sobre a placa no adesivo e deixar a temperatura ambiente ‘over night’.

 

29. Guardar placa no freezer – 20oC.

 

Analisar o produto da reação por eletroforese em gel 0,8% agarose, TAE 0,5X.