Protocolo para extração de DNA de Sangue - Fenol - RODRIGO

Sangue em álcool 70 – antes de começar observe o volume inicial de sangue nos tubos para se ter uma noção melhor de quanto TE usar para ressuspender o DNA ao fim da extração.

1. Centrifugar o DNA a 14000 rpm por 1,5 min.

2. Tirar todo o álcool do tubo com uma pipeta. (Lavar o sangue com Tris NH₄Cl (bancada) e solução salina 0,85% (bancada), conforme passos 2 à 8 do protocolo normal, não é necessário. Fazer apenas se a amostra estiver com aspecto “estranho” ou muito sujo.)

3. Ressuspender o pellet em 300µL de High TE (bancada) e vortexar. Se necessário, usar um bastão para esmagar os pellets nos tubos.

4. Adicionar 400µL de solução de lise de Madisen (bancada) previamente aquecida a 55°C e vortexar.

5. Adicionar 5-10µL de Proteinase K 20mg/mL (freezer) de acordo com a quantidade de material para ser lisado e vortexar.

6. Incubar amostras no banho a 55°C "over night" (observar a lise do material e deixar mais ou menos tempo conforme a necessidade). Vortexar algumas vezes durante o processo de lise do material.

7. Adicionar 10µL de RNAse 10µg/ml (freezer) ao material lisado (volume aproximado de 800µL). Deixar 3-5 min em temperatura ambiente.

8. Adicionar 1 volume (completar volume do tubo) de Fenol: Cloroformio: Álcool isoamílico 25:24:1 (geladeira). Agitar cuidadosamente os tubos por 10 min (cuidado para não sumir a marcação dos tubos porque costuma vazar).

9. Centrifugar à 14000 rpm por 10 min.

10. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo (aproveitar ao máximo o material disponível).

OBS: Os passos 8-10 podem ser repetidos até 3 vezes, caso haja necessidade (observar se não esta carregando material indesejado ao pipetar o sobrenadantes e observar a limpidez do pipetado). Se o passo de fenol for repetido em alguns tubos e não em outros, os outros podem aguardar na bancada até o próximo passo.

11. Fazer uma limpeza com Cloroformio: Álcool isoamílico 24:1 (geladeira) para limpar o fenol. Seguir os mesmos procedimentos feitos para o fenol (passos 8-10).

12. Precipitar o DNA com 100µL de acetato de amônio 7,5 M (geladeira) e completar o volume do tubo com isopropanol (geladeira), ambos previamente colocados no freezer. Inverter os tubos até a precipitação do DNA.

13. Após os DNAs terem precipitado eles podem ser cuidadosamente “pescados” com a pipeta (a ponteira é usada como anzol e não para pipetar o DNA) OU centrifugados à 14000 rpm por 15 min.

a) Se forem pescados: transferir cuidadosamente DNAs para tubos já contendo ±100µL de água miliQ ® deixar o DNA ressuspender na água por alguns minutos (se DNA estiver com aspecto sujo, colocar o tubo à 37ºC por 10-15 min) ® precipitar novamente DNA com 1/10-1/5 (10-20µL para 100µL de água) de acetato de amônio 7,5M gelado + 2x (200µL) o volume de etanol absoluto gelado ® centrifugar à 14000 rpm por 15 min ® descartar sobrenadante cuidadosamente (usar uma pipeta) ® deixar secar. Nos tubos onde sobrou o isopropanol, proceder conforme instruções a seguir

OBS: Passa a haver 2 tubos de uma mesma amostra ® tubo A com DNA pescado e tubo B com DNA centrifugado® não uni-los ® transferir conteúdo do tubo A para Banco (geralmente com DNA + limpo e + concentrado) e deixar tubo B (devidamente identificado) em outra bandeja no freezer.

b) Se forem centrifugados: descartar o sobrenadante invertendo o tubo ou pipetando o sobrenadante com muita atenção para não perder o DNA ® deixar secar (tubos abertos em temperatura ambiente ou alguns minutos na estufa).

14. Lavar DNAs com 100 µL de etanol 70 gelado® centrifugar à 14000 rpm por 15 min ® descartar sobrenadante cuidadosamente ® deixar secar bem.

15. Ressuspender o DNA em 50-100 µL de Low TE (geladeira), conforme o tamanho do pellet.

16. Incubar no banho a 37°C por 30 min ou mais.

17. Armazenar tubos à –20ºC.

Protocolo para extração de DNA - Fenol

Sangue em álcool 70 – antes de começar observe o volume inicial de sangue nos tubos para se ter uma noção melhor de quanto TE usar para ressuspender o DNA ao fim da extração.

18. Tirar todo o álcool do tubo com uma pipeta ou centrifugando (5 min à 3000 rpm) e virando cuidadosamente o tubo.

19. Adicionar 1000 mL de Tris NH₄Cl (bancada) previamente aquecido a 37°C e vortexar bem (se preciso, use uma ponteira para dissolver o pellet).

20. Incubar no banho a 37°C por 5 min.

21. Centrifugar à 3000 rpm por 10 min e descartar o sobrenadante com cuidado usando uma pipeta ou virando o tubo.

22. Repetir passos 2, 3 e 4.

23. Adicionar 1000 mL de solução salina 0,85% (bancada).

24. Vortexar bem e centrifugar à 3000 rpm por 10 min.

25. Descartar o sobrenadante com pipeta ou virando o tubo, deixando o pellet o mais “seco” possível.

26. Ressuspender o pellet em 300µL de High TE (geladeira)

27. Adicionar 400µL de solução de lise de Madisen (bancada) previamente aquecida a 55°C

28. Agitar os tubos e adicionar ±5µL de Proteinase K 20mg/mL (freezer) - a quantidade de Proteinase K pode variar, colocar mais (10µL por exemplo ) nos tubos em que houver mais material para ser dissolvido.

29. Vortexar e incubar no banho a 55°C "over night" (observar a dissolução do material e deixar mais ou menos tempo conforme a necessidade). Vortexar algumas vezes durante o processo de lise do material.

30. Vortexar o lisado (se necessário dividir o material em dois tubos de 1500 mL).

31. Adicionar 1 volume (completar volume do tubo) de Fenol: Cloroformio: Álcool isoamílico 25:24:1 (geladeira).

32. Agitar cuidadosamente os tubos por 10 min (cuidado para não sumir a marcação dos tubos porque costuma vazar).

33. Centrifugar à 14000 rpm por 7-10 min.

34. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo. Os passos 14, 15 e 16 podem ser repetidos até 3 vezes, caso haja necessidade (observar se não esta carregando material indesejado ao pipetar o sobrenadantes e observar a limpidez do pipetado). Pode ser interessante com Cloroformio: Álcool isoamílico 24:1 (geladeira) para limpar o fenol.

¨ completar volume do tubo com CAI; agitar tubos cuidadosamente por ±5 min; centrifugar à 14000 rpm por 7-10 min; pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo; continuar no passo 18.

35. Precipitar o DNA com 100µL de acetato de sódio 3M (ou acetato de amônio 3M) (geladeira) e completar o volume do tubo com isopropanol (geladeira). Inverter lentamente os tubos até a precipitação do DNA. (Se necessário incubar no freezer para precipitar)

36. Centrifugar à 14000 rpm por 15 min ou “pescar” o DNA com uma ponteira e transferi-lo para outro tubo.

37. Descartar o sobrenadante vagarosamente e deixar os tubos secando invertidos (até ficarem bem sequinhos).

38. Adicionar 50-100µL de Low TE (geladeira) (o volume vai depender do tamanho do pellet de DNA).

39. Incubar no banho a 37°C por 30 min ou mais.

40. Estocar na geladeira ou freezer.