Protocolo para extração de DNA 2

Tecidos frescos ou conservados em álcool 70

Limpeza prévia do tecido (patas de aranha ou aranha inteira)

1 - Colocar duas ou mais patas de aranha (ou aranha inteira) em um tubo de microcentrifuga de 1,5 ml.

Tecidos frescos os dois passos, para tecidos conservados pule o primeiro passo.

1.1 - Adicionar 1mL de etanol 70%

Vortexar, decantar 2'

Centrifugar 15'' a 8000 rpm (pulso)

Descartar sobrenadante

1.2 - Adicionar 1mL de Tris NH₄Cl previamente aquecido a 37°C

Vortexar e incubar no banho a 37°C por 5'

Centrifugar 15'' a 8000 rpms

Descartar o sobrenadante

Lise celular

2 - Macerar o tecido:

Tem dois jeitos de fazer isso:

1: colocar as patas (ou aranha) no tubo, adicionar 700µL de solução de lise de Madisen previamente aquecida a 50°C (ver abaixo), e picotar o tecido com uma tesoura de ponta fina até virar um pó fino diluído na solução

2: congelar as patas com nitrogênio liquido ou gelo seco (ver abaixo) e macerar dentro do próprio tubo, com a solução de lise, utilizando um pilão de tubo

2.1 - Vortexar

2.2 - Adicionar 10-20µL de Proteinase K (20mg/mL) - a quantidade de proteinase K pode variar de acordo com o tanto de tecido no tubo

2.3 - Vortexar e incubar no banho maria a 55°C "over night"

Extração do DNA

3 - Vortexar o lisado (Se necessário dividir o material em outros tubos eppendorf de 1,5mL)

3.1 - Adicionar 1 volume de Fenol: Cloroformio: Álcool isoamílico (25: 24: 1)

Agitar 10' por inversão lenta dos tubos

Centrifugar 13000 rpm 5' (centrífuga eppendorf)

Transferir o sobrenadante para um tubo novo

3.2 repetir passo 3.1 (opcional)

3.3 - Adicionar 1 volume de Cloroformio: Álcool isoamílico (24: 1)

Agitar 10' por inversão lenta dos tubos

Centrifugar 13000 rpm 5' (centrífuga eppendorf)

Transferir o sobrenadante para um tubo novo

Isolamento do DNA por precipitação

4 - Adicionar 100µL de Acetato de Amônio 7.5 M (ou acetato de sódio 3M)

4.1 - Adicionar 1 volume de isopropanol 95-100%gelado (ou 2 volumes de etanol 95-100%)

4.2 - Inverter até a precipitação do DNA (Se necessário incubar no freezer para precipitar)

Centrifugar 13000rpm 15' (centrífuga eppendorf)

Descartar o sobrenadante

Adicionar TE (o volume vai depender da quantidade de DNA obtida, em geral de 50-100µL)

Incubar no banho a 37°C 30'

Estocar na geladeira ou freezer (preferível)

Visualização em Gel de agarose

Tanto a extração de DNA como a PCR devem ser medidas em gel de agarose (ou poliacrilamida).

Gel de agarose 0,8% em TAE

PCR

Tampão de Reação 10X: 500mM de KCL; 100mM Tris-HCL pH 8,4; 1% Triton X-100

MgCl₂: 25mM

dNTPs: 25mM

Reação da PCR feita para 15µL:

1X Tampão da Reação ù

MgCl₂: 1,5 mM ú

dNTPs: 200 µM ú

Primers: 0,25- 1,0 µM ú por Tubo de reação

Taq: 0,5-1,5 unidades ú

DNA: 20-40 ng (1-2 µL) ú

Completar com H₂O mili Q û

Sequenciamento de DNA

Para o Mega BACE 1000

Reação para 10 µL:

4µL do kit DYEnamic ET- Dye Terminator cycle sequencing kit for MegaBACE

1µL de primer (5 µM)

2µL de DNA (PCR)

3µL de H₂O mili Q

Reagentes, etc

Congelamento com gelo seco: coloque o tecido no gelo seco, e depois coloque etanol, até congelar.

Solução de Lise de Madisen:

TRIS HCl 0,1 M pH 8,0; EDTA 40 mM pH 8,0; SDS 0,2%; NaCl 1 M