Protocolo para extração de DNA 1

Tecidos frescos ou conservados em álcool 70%

· Macerar ~200µL de tecido

· Transferir o material para um tubo eppendorf de 1,5mL

· Adicionar 1mL de Tris NH₄Cl previamente aquecido a 37°C

· Vortexar e incubar no banho a 37°C por 5'

· Centrifugar 3000rpm 10' (centrífuga eppendorf)

· Descartar o sobrenadante

· Novamente adicionar 1mL de Tris NH₄Cl previamente aquecido a 37°C

· Vortexar e incubar no banho a 37°C por 5'

· Centrifugar 3000rpm 10' (centrífuga eppendorf)

· Descartar o sobrenadante

· Adicionar 1mL de solução salina 0,85%

· Vortexar

· Centrifugar 3000 rpm 10' (centrífuga eppendorf)

· Descartar o sobrenadante

· Ressuspender o pellet em 300µL de High TE

· Adicionar 400µL de solução de lise de Madisen previamente aquecida a 50°C

· Vortexar

· Adicionar ~5µL de Proteinase K (20mg/mL) - a quantidade de proteinase K pode variar

· Vortexar

· Incubar no banho à 50°C "over night"

· Vortexar o lisado (Se necessário dividir o material em outros tubos eppendorf de 1,5mL)

· Adicionar 1 volume de Fenol: Cloroformio: Álcool isoamílico (25: 24: 1)

· Agitar por 10'

· Centrifugar 14000 rpm 5' (centrífuga eppendorf)

· Transferir o sobrenadante para um tubo novo

· Se necessário repetir mais um passo de fenol (tomar cuidado com fígado de réptil, anfíbio..)

· Opicional: Adicionar 1volume de Cloroformio: Álcool isoamílico (24: 1) - Agitar por 10'

· Adicionar 100µL de Acetato de Sódio 3M (pode ser outro sal) e completar com isopropanol gelado

· Inverter até a precipitação do DNA (Se necessário incubar no freezer para precipitar)

· Centrifugar 14000 rpm 15' (centrífuga eppendorf)

· Descartar o sobrenadante

· Adicionar Low TE (o volume vai depender da quantidade de DNA obtida)

· Incubar no banho a 37°C 30'

· Estocar na geladeira ou freezer