PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS DE PCR COM EXO/SAP PARA SEQUENCIAMENTO

Baseado em Exonuclease I, Shrimp Alkaline Phosphatase PCR Purification Protocol da Amersham Pharmacia Biotech

Método de purificação de produtos de PCR que utiliza Exonuclease I (Exo I) para digerir excesso de primers e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) para degradar excesso de nucleotídeos provenientes da PCR (Figure 1).

Figura 1. Purificação de produtos de PCR com Exo/SAP.

A reação de PCR faz uso de dois primers, dNTPs e DNA polimerase para produzir múltiplas cópias de uma seqüência de DNA específica. Quando a reação termina a maior parte dos primers e dNTP permanece intacta, e, se não retirados, irão interferir no sequenciamento. As enzimas Exonuclease I (Exo I) e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) removem estes materiais indesejados. Depois deste procedimento o sequenciamento é feito normalmente.

MATERIAIS NECESSÁRIOS

E70073Z Exonuclease I 10 unidades/µl em 20 mM Tris.HCl (pH 7.5) 5 mM 2-mercaptoetanol 50% glicerol

E70092X Shrimp Alkaline Phosphatase 1 unidade/µl em 25 mM Tris.HCl (pH 7.6) 1 mM MgCl 2 0.1 mM ZnCl 2 50% glycerol Suplementada com 10X SAP Dilution Buffer 200 mM Tris pH 8.0 100 mM MgCl2

Todas as misturas de nucleotídeos devem ser armazenadas a -20°C e colocadas em gelo quando em uso.

PROTOCOLO

1. Para cada reação de PCR:

DNA amplificado por PCR 5 µl

Exonuclease I (10 unidades/µl) 1 µl

Shrimp Alkaline Phosphatase (1 unidade/µl) 1 µl

TOTAL 7 µl

· Misture e incube a 37°C por 30-45 min.

· Inative as duas enzimas aquecendo a 80°C por 15 minutos.

O DNA está pronto para ser utilizado em uma reação de sequenciamento.

1. Mix para várias reações de PCR:

Exonuclease I (10 unidades/µl) 100 partes

Shrimp Alkaline Phosphatase (1 unidade/µl) 100 partes

10X SAP Dilution Buffer 50 partes

Água deionizada 250 partes

TOTAL 500

· Utilize quantidades iguais de mix e DNA amplificado por PCR em cada reação (ex.: 5 µl de mix para cada 5 µl de DNA amplificado por PCR).

· Misture e incube a 37°C por 30-45 min.

· Inative as duas enzimas aquecendo a 80°C por 15 minutos.

O DNA está pronto para ser utilizado em uma reação de sequenciamento.