REAGENTES E SOLUÇÕES

1- TRIS HCl 1M pH 7,65
Volume : 1 litro
Tris base: 121,11g
Ajustar pH /,65 c/ HCl (= 4 ml).
q.s.p. 1000 ml c/ ddH₂O.
Autoclavar.

2- TRIS 1M pH 8,0
Volume: 1 litro
Tris base: 121,11g
Ajustar pH 8,0 c/ HCl (=42 ml).
q.s.p. 1000 ml c/ ddH₂O.

3- TRIS 1M pH 7,5
Volume: 100 ml
Tris base: 12,11g
Ajustar pH 7,5 c/ HCl (= 5,0 ml).
q.s.p. 100 ml c/ H₂O.
Autoclavar e estocar em alíquotas.

4- EDTA 0,5M pH 8,0 (SIGMA - Obs.: Para DNA)
Volume: 50 ml
EDTA: 9,305g (PM = 372,22)
Ajustar pH = 8,0 com NaOH pellet ou concentrado até dissolver.
Após dissolução, terminar de ajustar com NaOH conc. até pH 8,0.
q.s.p. 50 ml c/ ddH₂O.
Autoclavar e aliquotar.

5- EDTA 0,5M pH 8,0 (RIEDEL - Obs.: Para tampão de corrida)
Volume: 200 ml
EDTA 2H₂O: 37,22g
Ajustar pH até próximo de 8,0 c/ NaOH pellet até dissolver.
Após dissolução ajustar pH 8,0 com NaOH conc.
q.s.p. 200 ml com ddH₂O.
Autoclavar.

6- NaCl 5,0M
Volume: 100 ml
NaCl: 29,22g
q.s.p. 100 ml com ddH₂O.
Autoclavar.

7- MgCl 5,0M
Volume: 100 ml
MgCl₂.6H₂O: 20,33g
q.s.p. 100 ml.
Autoclavar.

8- DTT - DITHIOTHREITOL
Volume: 5 ml
DTT: 0,773g
q.s.p. 5 ml com água estéril.
Aliquotar em microtubos e estocar a -20ºC.

9- SDS ( sodium dodecil sulfate - sigma - nuclease free )
Volume: 10 ml
SDS: 1g
Aquecer a 68ºC para dissolver e ajustar pH 7,2 com HCl diluído.
q.s.p. 10 ml com ddH₂O estéril.
OBS.: Usar máscaras para pesar o SDS (IRRITANTE DE MUCOSA).
Vidraria ao forno.

10- SDS 10% P LAVAGEM DE MEMBRANAS
Volume: 200 ml
SDS: 20g
Dissolver em 150 ml de ddH₂O estéril e aquecer a 68ºC.
q.s.p. 200 ml com ddH₂O estéril.

11- ACOONH₄ 4 M - ACETATO DE AMÔNIO
Volume: 100 ml
ACOONH₄: 30,8g
q.s.p. 100 ml com ddH₂O estéril.
Esterilizar por filtração.

12- ACOONH₄ 7,5 M
Volume: 100 ml
ACOONH₄: 57,75g
q.s.p. 100 ml com ddH₂O estéril.
Esterilizar por filtração.

13- 20X SSC ( NaCl 3M / Citrato Trissódico.2H₂O 0,3M)
Volume: 4 litros
NaCl: 701,2g
Citrato: 352,9g
Ajustar pH 7,0 com HCl.
q.s.p. 4000 ml.
Autoclavar.

14- BROMETO DE ETÍDIO ( MUTAGENICO ) 10 mg/ml
USAR MÁSCARAS E LUVAS, E PESAR EM CAPELA DE EXAUSTÃO

Volume: 10 ml
BROMETO DE ETÍDIO: 100 mg
q.s.p. 10 ml com ddH₂O estéril.
Agitar até dissolução.
Estocar a 4ºC, no escuro.

15- NaOH 1M
Volume: 100 ml
NaOH: 4g
q.s.p. 100 ml c0m ddH2O estéril.
* Estocar em frasco plástico.

16- TAMPÃO FOSFATO pH 7,0
A = 2.90g NaH₂PO₄ |
B = 5.16g Na₂HPO₄ | PARA 100 ml

17- NaOH 3M
Volume: 100 ml
NaOH: 12 g
q.s.p. 100 ml com ddH₂O.
Estocar em frasco de plástico.

18- SALINA 10X CONC. ( PARA 0.85% )
Volume: 1000 ml
NaCl: 85 g
q.s.p. 1 litro com ddH₂O.
Autoclavar.

19- FORMAMIDA DEIONIZADA
( TODA VIDRARIA E BARRA MAGNÉTICA ESTERILIZADA NO FORNO )
Volume: 50 ml
FORMAMIDA: 50 ml
Resina ( MIXED-BED AMBERLITE MB.1 monobed Resin ): 5 g
Agitar por 30 min à temperatura ambiente.
Filtrar 2 X em WHATMAN Nº 1.
Aliquotar e estocar a -20ºC.

20- DENHARDT'S 100 X CONC.
Volume: 50 ml
2% PVP - ( POLIVINILPIRROLIDONA ): 1 g
2% FICOLL 400: 1 g
2% FISH SKIN GELATIN : 1 g
q.s.p. 50 ml com ddH₂O.
Aliquotar e estocar a - 20ºC.

21- ACETATO DE SÓDIO 3M pH 5.2
Volume: 100 ml
Acetato de Sódio.3H₂O: 40.81g
Ajustar pH 5.2 com Ácido Acético Glacial.
q.s.p. 100 ml com ddH₂O.
Autoclavar.

22- CaCl₂ 1M
Volume: 50 ml
CaCl₂: 7.35g
q.s.p. 50 ml ddH₂O.
Autoclavar.

23- NEUTRALIZATION BUFFER - ( TRIS HCl 0,5M pH 7.5/NaCl 2,5M )
Volume: 2 litros
TRIS BASE: 121,11g ou TRIS HCl: 157,6g
NaCl: 292,5g
Ajustar pH 7,5 com HCl ou NaOH.
q.s.p. 2000 ml com ddH₂O.
Autoclavar.

24- WASH BUFFER - ( TRIS HCl 0,1M pH 7,5/NaCl 0,5M )
400 ml de NEUTRALIZATION BUFFER.
1600 ml de ddH₂O.

25- STAIN BUFFER - ( TRIS HCl 0,1M pH 9,1/NaCl 0,1M/MgCl₂ 5mM )
Volume 2 litros tampão 1X
Tris base: 24,22g ou 31,52g Tris HCl
NaCl: 11,75g

MgCl₂.6H₂O: 2,05g
Acertar pH 9,1 com HCl conc.
q.s.p. 2000 ml com ddH₂O
OBS.: PARA 10 X: 121,11g Tris base ou 157,6g de Tris HCl
58,75g NaCl
10,25g MgCl₂.6H₂O
q.s.p. 1000 ml.

26- COMPLEX DILUTION BUFFER
40 ml NEUTRALIZATION BUFFER
10 ml TWEEN 20
150 ml ddH₂O.

27- DNA BLOCK
Volume: 1 litro
Caseína: 10g
Neutralization Buffer: 200 ml
Calf Skin Gelatin: 30g
TWEEN 20: 500 µl
q.s.p. 1000 ml com ddH₂O.
OBS.: Dissolver a caseína com NaOH conc., separadamente.

28- DYKES HYBRIDIZATION SOLUTION
Volume: 50 ml
20XSSC: 12,5 ml
Denhardt's 100X : 0,5 ml
Formamida Deionizada: 22,5 ml
Tampão Fosfato pH 7,0 - 0,5M : 2,5 ml
Dextran: 5,0 g
SDS 10%: 500,0 µl
q.s.p. 50,0 ml c/ ddH₂O
Estocar a -20ºC.
Esterilizar por filtração.

29- TE ( LOW ) pH 8,0 ( TRIS HCl pH 8,0 10 mM/EDTA pH 8,0 1M )
Volume: 50 ml
0,5 ml Tris HCl 1M pH 8,0
0,1 ml EDTA 0,5M pH 8,0
q.s.p. com ddH₂O 50 ml.

30- HIGH TE pH 8,0 ( TRIS HCl pH 8,0 100 mM/EDTA pH 8,0 40 mM )
Volume: 50 ml
5,0 ml Tris HCl 1M pH 8,0
4,0 ml EDTA 0,5M pH 8,0
q.s.p. com ddH₂O 50 ml.

31- STE ( TRIS HCl pH 8,0 10 mM/NaCl 100 mM/ 1mM EDTA pH 8,0 )
Volume: 50 ml
0,5 ml Tris HCl 1M pH 8,0
0,1 ml EDTA 0,5M pH 8,0
1,0 ml NaCl 5M
q.s.p. com ddH₂O 50 ml.

32- SALINA 0,85%
Volume: 100 ml
10 ml salina 10X conc.
90 ml ddH₂O estéril.

33- TRIS HCl 0,17M pH 7,65 : NH₄Cl 0,155M
28 ml NH₄Cl 5M
17 ml TRIS HCl 1M pH 7,65
q.s.p. com ddH₂O estéril 1000 ml.

34- MISTURA DE LISE DE MADISEN
( TRIS HCl 0,1M pH 8,0/EDTA 0,5M pH 8,0/SDS 0,2%/NaCl 1M )
10 ml Tris HCl 1M pH 8,0 "Nuclease Free"
8 ml EDTA o,5M pH 8,0
2 ml SDS 10%
20 ml NaCl 5M
q.s.p. com ddH2O estéril 100 ml.
OBS.: Toda avidraria deve ser esterilizada no forno a 180ºC por 2 horas.

35- CLOROFÓRMIO/ÁLCOOL ISOAMÍLICO ( 24 : 1 )
Volume: 100 ml
96 ml Clorofórmio destilado.
4 ml álcool isoamílico destilado.

36- FENOL SATURADO COM TRIS HCl
Destilar o fenol e estocar em alíquotas a -20ºC ou sob gás N₂.

Saturar com Tris HCl 0,1M pH 8,0 ( igual volume ) até que o sobrenadante adquira pH 7,5.

A última lavagem é feita com Tris HCl 0,1M pH 8,0/Mercapto etanol 0,2% e medir o pH com papel até pH 8,0, então, remover a fase aquosa.
Estocar em alíquotas a -20ºC.

37- ETANOL 95% OU ABSOLUTO
Etanol destilado e estocado a -20ºC.
Aliquotar.

38- ETANOL 75%, 80% OU 70%
75,80 ou 70 ml de etanol destilado.
25,20 ou 30 ml de ddH₂O estéril.
Aliquotar e estocar a -20ºC.

39- ISOPROPANOL ABSOLUTO
Isopropanol destilado.
Estocar a 4ºC.

40- TBE 5X ( TAMPÃO DE CORRIDA )
Volume: 2 litros
Tris base: 108g
Ácido bórico: 55g
EDTA 0,5M pH 8,0: 40 ml ( pesar 7,444g )
q.s.p. com ddH₂O 2000 ml
Dissolver, filtrar e autoclavar.

41- TAMPÃO DE AMOSTRA 5X
( TBE 5X/AZUL DE BROMOFENOL 0,25%/XILENOCIANOL 0,25%/FICOLL 400 25% )
Volume: 50 ml
Azul de Bromofenol: 0,05g.
Xilenocianol: 0,05g.
FICOLL 400: 5,00g.
TBE 5X q.s.p. 50 ml.

42- IPTG 100 mM
(ISOPROPYL THIO--D-GALACTOSIDE)
23,8 mg IPTG.
1 ml de ddH₂O.
Estocar em alíquotas a -20ºC.

43- X-GAL 4%
Volume: 100 l
(5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLYL-D-GALACTOSIDEO)
4 mg X-gal.
0,10 ml DMF (DIMETILFORMAMIDA).
Preparar pouco tempo antes de usar. Usar no escuro.

44- SOLUÇÃO DE DESNATURAÇÃO
(NaOH 0,5M / NaCl 1,5M)
Volume: 1 litro
20 g NaOH
87,66 g NaCl
q.s.p. com ddH₂O 1000 ml.
Armazenar em frasco plástico.

45- SOLUÇÃO DE NEUTRALIZAÇÃO
(TRIS HCl 1M pH 7,5 / NaCl 1,5M)
Volume: 1 litro
121,11 g Tris
87,66 g NaCl
Acertar pH 7,5 com HCl conc.
q.s.p. com ddH₂O 1000 ml.
Filtrar e autoclavar.

46- TAMPÃO DE DIGESTÃO REACT 2 10 X CONC.
Volume: 10 ml
Tris HCl estéril, 500 mM pH 8,0: 5,0 ml
MgCl2 estéril, 100 mM: 1,0 ml
NaCl estéril, 500 mM: 1,0 ml
q.s.p. com ddH2O estéril 10,0 ml.
Aliquotar em microtubos e estocar a -20ºC.

47- PEG/NaCl
(20% Polyethylene Glycol 6000 / NaCl 2,5 M)
Volume: 50 ml
10 g de Polyethylene Glycol 6000
25 ml NaCl 5M
q.s.p. com ddH₂O estéril 50 ml.
Autoclavar e estocar a 4ºC.

48- TAE 50 X
Volume: 1 litro
242 g de TRIS BASE
57,1 ml Ácido Acético Glacial
100 ml de EDTA 0,5M pH 8,0
q.s.p. com ddH₂O 100 ml.
Autoclavar.

49- LB MEDIUM (LURIA - BERTANI MEDIUM)
10 g Bacto-tryptone
5 g Bacto-yeast extract
10 g NaCl
Ajustar pH 7,4 com NaOH.
q.s.p. com ddH₂O 1000 ml.
Autoclavar e abrir em ambiente estéril.

50- BCIP
50 mg BCIP
1 ml de DIMETILFORMAMIDA (DMF)
Armazenar a 4ºC.

51- NBT
75 mg NBT
1 ml DMF 70% em ddH₂O.

52- EDTA PARA COLETAR SANGUE (1% EDTA)
Volume: 100 ml
1 g de EDTA
q.s.p. ddH₂O.
Usar 0,5 ml de solução para cada 5,0 ml de sangue ou 1 gota de uma solução 10% de EDTA (para não precisar secar).

53- DENHARDT'S 20 X
( BSA 0,2% / PVP 0,2% / FICOLL 400 0,2% )
Volume: 50 ml
0,2 g BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)
0,2 g PVP (POLIVINILPERROLIDONA)
0,2 g FICOLL 400
q.s.p. com ddH₂O estéril 50 ml.
Estocar a -20ºC.

54- 10 X SSPE
(NaCl 1,8M / NaHPO₄.2H₂O 50 mM / NaH₂PO₄.H₂O 50mM / EDTA pH 8,0 10 mM)
10,52 g NaCl
0,89 g NaHPO₄.2H₂O
0,69 g NaH₂PO₄.H₂O
2,0 ml EDTA 0,5M pH 8,0
Ajustar pH 8,0 com HCl ou NaOH.
q.s.p. com ddH₂O 100 ml.
Autoclavar.

55- SOLUÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO PARA GEL SECO
(5 X SSPE / 5 X DENHARDT'S / 0,5% SDS)
Volume: 20 ml
5,0 ml Denhardt's 20 X
10,0 ml 10 X SSPE
1,0 ml SDS 10%
q.s.p. com ddH₂O estéril 20 ml.