TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES

6 placas de LB com antibiótico e X-gal IPTG

1: controles a. - pUC12 sem inserto

b. - pUC12 clivado

c. - pUC12 religado

2: pUC com inserto a - 1:1

b - 1:3

c - 3:1

1. células de E.coli JM109 competentes estão estocadas a -70ºC

2. tira-se o eppendorff do freezer e deixa-se descongelar em gelo ~ 30 min.

3. tomar 200µl das células e adicionar 3 µl de DMSO puro (na capela)

4. adicionar o plasmídeo pUC12 com ou sem inserto (~10 a 20 ng ou até 50 ng) em volume máximo de 10 µl ( 5% volume das células )

5. colocar no gelo por 30 min

6. deixar 2 a 4 min. a 42ºC (3 min)

7. 1 a 3 min. no gelo

Plaqueamento:

a. adicionar as células anteriores a 2ml de meio LB (sem antibiótico).

b. agitação moderada por uma hora a 37ºC

c. somente pUC sem inserto, plaquear 100µl do volume total de 2ml

d. demais transformantes - 2,0 ml são centrifugados (3000 rpm 10min) e o pellet ressuspendido em 100µl de LB (sem antibiótico) faz-se o plaqueamento

Nota: o LB ágar para plaquear contêm 0,5 mM de IPTG e 40µg/ml de X-gal 200µg/ml de ampicilina (melhor 100 µg/ml se ampicilina é pura)

e. deixar 37ºC overnight

f. contar as colônias (brancas e azuis) melhor averiguar a cor em lupa estereoscópica