PROTOCOLO DE DOT BLOT PARA HIBRIDIZAÇÃO

Quantidade de DNA humano ótima para o Dot : 200 ng que deve estar quebrado (shared) por vórtex (10 min) ou passagem em agulha 19 gauge.

Procedimento 1: preparação das amostras de DNAs (desnaturação)

- 10% v/v de NaOH 3M da solução com DNA

- deixar 5 a 10 min. à 37ºC

- acrescentar um volume igual de AcNH₄ 2M

Procedimento 2: aplicação das amostras à membrana

- molhar a membrana em AcNH₄ 1M

- montar o aparelho c/membrana e fazer vácuo, apertando os parafusos

- aplicar 100 µl de AcNH₄ 1M em cada well e fazer vácuo

- aplicar a amostra de DNA desnaturada e fazer vácuo

- aplicar 100 µl de AcNH₄ 1M e fazer vácuo

- retirar a membrana, marcar e secar

- assar a membrana entre papel filtro a 80 ºC por 1 hora