PROTOCOLO DE HIBRIDIZAÇÃO E REVELAÇÃO DE MEMBRANAS COM SONDAS BIOTINILADAS E SUBSTRATOS NBT\BCIP

Hibridização

1. molhar a membrana em 2X SSC

2. bloquear a membrana com DNA block a 50ºC por 1 hora

3. lavar em 2X SSC por 1 minuto

4. hibridizar a 42ºC com sonda em solução de Dykes overnight (1 ml sol./10 cm²)

5. retirar toda a sonda, guardando-a a 4ºC

Lavagens da membrana para retirada do excesso de sonda

6. - 2X SSC, 0.1% SDS por 3 minutos 2X à T.A.
- 1X SSC, 0.1% SDS por 3 minutos 2X à T.A.
- 0.1X SSC, 0.1% SDS por 30 minutos (Lavagem de estringência - Variável)
- 2X SSC por 3 minutos à T.A.

7. bloquear a membrana com DNA block por 45 minutos à T.A.

8. lavar rapidamente em 2X SSC

9. incubar por 10 minutos em Complex Dilution Buffer

10. incubar com conjugado (Streptavidina/Fosfatase alcalina) dilluído 1:1000 em Complex Dilution Buffer por 45 minutos à T.A. (1 ml de solução / cada 10 cm² de membrana)

Lavagens para retirar excesso de conjugado

11. Wash Buffer por 5 a 10 minutos à T.A. 4X

12. Stain Buffer por 5 a 10 minutos à T.A. 2X

Revelação com substratos NBT/BCIP

13. Revelar com: 33 µl de BCIP
44 µl de NBT
10 ml de Stain Buffer

Costuma-se trocar após 1 hora (tempo de revelação é variável)