PCR com primers Dynal Forward e Reverse, para amplificação de insertos em M13, pUC e derivados com o sítio de multiclonagem no gene da -galactosidase.

Pré-Mix para amplificação para 5 tubos de 50 µl

I. ddH₂O 152,5 µl

II. dNTPs (1,25 mM cada) 40 µl (200 µM)

III. Tampão 10X (Promega) 25 µl (1 X)

IV. MgCl₂ (25 mM) 15 µl (1,5 mM)

V. primers Set A ou B 5 µl (0,1 M)

VI Taq Polimerase (Promega) 2,5 µl (2,5 unid./tubo 50 µl)

240 µl 5 X 48 µl

5 X 2 µl de DNA (~ 100 ng) ou colônia bacteriana

Sequenciamento a partir da fita fixa às beads magnéticas:

- Set A primers Dynal: permite sequenciar com primer M13 forward (fita positiva)

- Set B primers Dynal: permite sequenciar com primer M13 reverse (fita complementar)

Amplificar com programa MAGNB1 por 30 ciclos

1. desnaturação 94ºC por 5 minutos

2. anelamento 58ºC por 1 minuto

3. extensão 72ºC por 5 minutos

4. desnaturação 94ºC por 1 minuto

5. volta à etapa 2 por 30 ciclos

6. 72ºC por 10 minutos

7. 4ºC

Preparação das Beads magnéticas com Streptavidina

1. sedimentar as beads com o magneto e remover o sobrenadante

2. adicione 3 vol. de binding solution

3. sedimentar as beads com o magneto e remover o sobrenadante

4. ressuspender em 2 vol. de binding solution

quando usar Magnetic Beads Dynal vendidas por PROMEGA
ressuspender com o mesmo volume inicial

Binding solution: 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 2M NaCl

Purificação dos produtos de PCR

1. transferir 45 l da reação de PCR para um tubo contendo 45l de beads preparadas

2. incubar à temperatura ambiente por 15 minutos, misturando ocasionalmente

3. sedimentar as beads com o magneto e remover o sobrenadante

4. acrescentar 50 l de binding solution

5. sedimentar as beads com o magneto e remover o sobrenadante

6. ressuspender as beads em 50 l de Low TE (10mM Tris-HCl pH7,5, 1mM EDTA)

Separação das fitas

a. sedimentar as beads com o magneto e remover o sobrenadante

b. adicionar 11 l de NaOH 0,1N

c. deixar à temperatura ambiente por 5 minutos

d. sedimentar as beads com o magneto e coletar 10 l do sobrenadante em novo tubo

- tratamento das fitas separadas

I. Para as beads (com a fita fixa)

I.a lavar as beads com 50 l de NaOH 0,1N

I.b lavar as beads com 50 l de binding solution

I.c lavar as beads com 50 l de Low TE

I.d ressuspender em 13 l de ddH₂O

II. Para o sobrenadante (com a fita livre)

II.a adicione 1 l de HCl 1N

II.b adicione 2 l de ddH₂O

Sequenciamento das fitas, protocolo para fitas simples Kit Autoread (T7) adaptado

para o uso de fitas separadas por Magnetic Beads com Streptavidina (DYNAL)

Diluição de primers

Primers diluídos para volume de 50 l (para se ter 1 pmol em 2 l)

diluição de uso (0,5 pmol/l) solução inicial 2,1 pmol/l - 11,9 l

ddH₂O - 38,1 l

Anelamento do primer ao DNA molde de fita simples (fita fixa ou livre)

1) adicione 2 l do primer fluorescente diluído (0,5 pmol/l) - o primer Universal (forward) é usado com a fita fixa à bead amplificada com o Set A e o primer Reverse é usado com a fita fixa à bead amplificada com o Set B. Para as fitas livres é o contrário

2) adicione 2 l do Annealing Buffer -- Volume Total de 17 l.

3) adicione ao tubo 13 l do ssDNA (fixo nas beads ou livre)

4) homogeneizar gentilmente com a pipeta mantendo a amostra no fundo do tubo

5) Incubar a 60ºC por 10 minutos

6) coloque à temperatura ambiente por no mínimo 10 minutos e centrifugue brevemente

7) adicione 1 l de Extension Buffer à reação de anelamento

8) proceder imediatamente à reação de sequenciamento

8.I. adicione 2 l de T7 DNA pol. diluída (2u/l) Enz.Dilut.Buffer frio

8.II. colete as amostras no fundo do tubo por centrifugação

8.III. adicione 4,5 l desta mistura homogeneizada com pipeta a 2,5 l de cada mix A, C, G e T pré-aquecidos a 37ºC, rapidamente a cada tubo

8.IV. Incubar a 37ºC por 5 minutos

8.V. adicionar 5 l de Stop solution homogeneizando

8.VI. coloque no gelo ou estoque a -20ºC

8.VII. aquecer a 90ºC por 2 a 3 minutos e depois esfrie imediatamente no gelo

8.VIII. separe as beads com o magneto e aplique 6 l no gel de sequenciamento