PROTOCOLO PARA ELETROPORAÇÃO DE BACTÉRIAS

1-Consultar disponibilidade de uso do eletroporador (LGMM). Colocar as cubetas de eletroporação (para bactérias - 0,1 mm de gap) identificadas no gelo.

2- Pegar eppendorfs contendo 40 ul de bactérias concentradas para eletroporação armazenadas a -70 C e descongelá-las no gelo por 15 minutos.

3- Acrescentar a cada eppendorf 1 ul de DNA (se vier de mini-prep, deve ser diluído 1:100; use 100 pg a 1 ng; algumas ligações contêm muito sal, por isso recomenda-se usar 0,5 ul se a ligação for fácil).

4- Deixar incubando no gelo por 5 min.

5- Passar para uma das cubetas de eletroporação o conteúdo dos eppendorfs SEM DEIXAR BOLHAS!

6- Ir para a sala de eletroporação levando todo o material necessário (cubetas no gelo, pipetas Pasteur, chupeta, 1 ml de meio SOC por eletroporação, papel higiênico e álcool).

7- Preparar o eletroporador conforme mostrado no protocolo na parede em frente ao eletroporador, utilizando 1700 volts.

8- Abrir a lata de pipeta Pasteur e preparar uma delas com a chupeta, desatarraxar a tampa do tubo com meio SOC.

9- SECAR A CUBETA e colocá-la na câmara.

10- Apertar duas vezes o botão de choque (anotar o tempo em que ocorreu o choque para ver a eficiência).

11- IMEDIATAMENTE APÓS O CHOQUE, adicionar 1000 ul de meio SOC e retirar a solução da cubeta com a pipeta Pasteur, passando-a para um eppendorf.

12- Anotar o uso no caderno de controle.

13- Incubar os tubos a 37 ºC por 1 hora.

13- Plaquear em LB ágar Amp quantidades apropriadas (1 e 10, 10 e 100 ou 30 e 300 ul) dependendo da eficiência esperada. Guardar o restante em geladeira para plaquear mais, se preciso, no dia seguinte. Incubar as placas por 16 - 20 h, retirando da estufa antes que se formem colônias satélites.