1- O substrato (GAP) liga na enzima
2- O grupo sulfidril do sítio ativo (resíduo CYS) forma um tiohemiacetal com o GAP.
3- NAD+ oxida o tiohemiacetal em um aciltioéster.
4-O NADH formado é substituído por um NAD+
5-Um intermediário Tioéster sofre ataque nucleofílico pelo Pi, o que regenera a enzima e forma 1,3-BPG.