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"Estrutura, regulação e _______".
Auxilio .
Stryer
 

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Neste projeto o objetivo central é entender a ação do Ca²⁺ na estrutura, regulação e função da BM V. Em conjunto com a Dr. Martha Sorenson e o Dr. R. Larson estamos investigando o papel deste íon na regulação da interação entre a CaM e a BM V. Dados obtidos com espectroscopia de fluorescência monitorada pelos triptofanos intrinsecos da BM V mostraram um decaimento no centro de massa, sem desvio do espectro. Estes resultados sugerem que a ligação do Ca²⁺ não modifica o ambiente em redor dos triptofanos responsáveis pela emissão. Este efeito (K_0.5 0,038 µM) é progressivo até » 100 µM e mantido até concentrações maiores de Ca²⁺ (15-20 µM) (Carvalho et al., 1995, 1996). Experiências com gel filtração em cromatografia líquida de alta resolução demostraram a dissociação de CaM da molécula de BM V nas mesmas condições. Os dados demonstram que concentrações sub-micromolares de Ca²⁺ estimulam a dissociação da CaM da molécula da cadeia pesada da BM V (Cameron et al., 1996,1997). Por outro lado resultados obtidos em experimentos de co-sedimentação (aonde a actina é utilizada para ligar a BM V em condições de rigor e precipitar) mostram que aumento da concentração de Ca²⁺ de 0 até 1 µM provocam a reassociação da CaM a cadeia pesada (Cameron et al., 1996b,1997).
Este conjunto de dados nos leva a pensar que a CaM se encontra dissociada da BM V em concentrações de Ca²⁺ no estado de repouso e que quando a BM V se encontra associada a actina, a entrada do Ca²⁺ na célula provoca a reassociação da CaM a BM V. Estes resultados conferem uma pista importante sobre o funcionamento da BM V in vivo (Cameron et al., 1997).
Demonstramos que o Ca²⁺ provoca a dissociação da CaM da cadeia pesada da BM V. Na presença de actina, entretanto, a CaM se associa à cadeia pesada. Estes dados mostram que a regulação da BM V é mediada pelo menos por uma tríade de fatores e que a proteína é regulada de forma diferente em em presença ou ausência de actina (Cameron et al 1996, 1997).
Atualmente somos capazes de purificar a BM-V em pintos, com rendimento 5 a 10 vezes maior do que o descrito por Cheney (1993). Estamos iniciando uma nova abordagem experimental para a medição da estequiometria entre as CaM e a cadeia pesada da BM V.

Ver: Cameron, L. C., Carvalho, R. N., de Araújo J. R. V., Martins-Teixeira F., Santos, A. C., Tauhata, S., Larson, R. E. & Sorenson, M. (1998) “Fluorescence quenching and calmodulin dissociation induced by calcium in brain myosin V”. Archives of Biochemistry and Biophysics, 354#2
 

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Um dos dogmas centrais da neuroquímica é que a síntese de proteínas se dá exclusivamente no soma neuronal. Estudos efetuados pelo grupo dos Dr. Jose Sotelo e Dr Juan Benech (Benech et al., 1982; Benech et al.1994) e de outros grupos (Cutillo et al., 1983; Chun et al., 1995) tem demonstrado que a síntese de proteínas pode ocorrer tambem a nível do axônio. Nosso interesse é verificar se a BM V é sintetizada localmente no axônio e como esta síntese é regulada por Ca²⁺ já que estudos anteriores demonstraram que a síntese de proteína é modificada pela entrada do Ca²⁺ na célula (Benech et al.1994).
O desenho experimental usa uma técnica de oferta de aminoácido marcado ao nervo ciático e análise por SDS-PAGE e posterior autoradiografia para identificação de proteínas sintetizadas localmente. O tempo de exposição (1 hora) é adequado para que não seja possível a influência dos sistemas de transporte rápidos, o que mascararia os resultados.
Dados preliminares, obtidos pelo estudante de mestrado Aldo Calliari, mostraram que a BM V esta presente no axoplasma de nervo ciático. Esta é a primeira vez que é descrita aa presença de BM V em sistema nervoso periférico. As primeiras expêriencias utilizando SDS-PAGE e Western Blot como verificadores, indicam que a BM V é sintetizada localmente.
Estes dados apontam para uma dois alvos: o primeiro é o de usar a BM V como sonda para o estudo da síntese local e o segundo é entender como e porque uma proteína de transporte de alto peso molecular deve e precisa ser sintetizada a nível local.
O entendimento destes processos podem estabelecer bases moleculares para o entendimento da função da BM V no papel de carreador de melanócitos e de vesículas sinápticas. A compreensão da utilização de aminoácidos a nível local pode ser de valia para aprendermos sobre processos de síntese de proteínas. Este conhecimento poderá auxiliar, no futuro, o tratamento de pacientes com síndromes convulsivas e doenças degenerativas.
 

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A fosforilação é um importante mecanismo para a regulação de proteínas, pois um mesmo sinal pode provocar a ativação ou inibição de proteínas diferentes. Várias ATPases mantém intermediários fosforilados ou são reguladas por fosforilação. A BM V é fosforilada pela CaM K II. O processo de fosforilação é dependente de Ca²⁺, CaM e ATP. A fosforilação ocorre na estrutura de "coiled-coil" da BM V, o que pode significar que seja um sistema de regulação para a ligação da proteína ao seu alvo (Coelho e Larson, 1993). Embora não se conheça o mecanismo definitivo, Prekeris e cols. (1996) postularam que a ligação da BM V a vésicula sináptica seja dependente de Ca²⁺ e fosforilação.
Em colaboração com o Dr. Foued Espindola e o Dr. M. Coelho, que foi o primeiro a descrever os efeitos da fosforilação e da hidrólise mediada por calpaína na BM V, pretendemos verificar o efeito da fosforilação na BM V.
A fosforilação é um sinal em processos de stress metabólico. Conhecer sobre a fosforilação na BM V nos possibilitará saber se esta proteína esta envolvida em algum tipo de resposta durante processos de resposta metabólica durante processos de jejum, trauma e sepse.
Utilizaremos técnicas de espectroscopia de fluorescência para medir modificações conformacionais na molécula da BM V induzidas por fosforilação. Estas mudanças serão acompanhadas pela análise das propriedades de ligação da CaM a BM V e de possíveis mudanças de afinidade por Ca²⁺. A afinidade e a ligação da BM V a actina, assim como a modulação da atividade ATPásica da BM V possibilitaram o entendimento do sistema como um todo. Estas informações reunidas tornaram factível o conhecimento da regulação da função da cauda da BM V.
 

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Os danos do stress oxidativo tem seus efeitos estudados em diversos sistemas biológicos (Hermes-Lima e Storey, 1996). Alterações na estrutura e função das miosinas tem sido descritas em diversos modelos experimentais para estudos de efeitos de oxidação. Diversos efeitos tem sido apontadas como causadores de dano oxidativo, entre eles as doenças degenerativas, o stress metabólico, injúrias ambientais e acidentes vasculares que provocam a deficiência de aporte energético na célula.
Nosso interesse principal reside nas possibilidades de danos oxidativo causados por acidentes vasculares encefálicos (AVE). Os AVE são a principal causa de dano neural nas sociedades ocidentais com incidência crescente principalmente em grandes centros urbanos. A ideia inicial reside em testar as atividades ATPásicas das duas proteínas, suas afinidades por substrato e actina, suas capacidades de conferir motilidade em ensaios de filamentos deslizantes para entender como o stress oxidativo pode afetar a maquinaria de transporte intra-neuronal.
Em conjunto com o Dr. Marcelo Hermes Lima do Grupo de Pesquisas em Radicais de Oxigênio e a Srta. Flávia Meneses, estamos iniciando estudos de efeitos de radicais livres em miosinas II e V encefálicas. Para isto estamos otimizando procedimentos de purificação de miosina II que possam ser compatíveis com a purificação já estabelecida de BM V.
 

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Os mecanismos pelos quais a apoptose (morte celular programada) acontecem são desconhecidos e seu papel na neurogênese somente recentemente vem sendo estabelecido (Pinón LG; Linden R, 1996). Em conjunto com o Dr. Rafael Linden, a doutoranda Luciana Chiarini e Leandro T. Oliveira estamos estudando o perfil de distribuição da BM V durante o desenvolvimento da retina de ratos (Rehen et al., 1996). Nosso objetivo é avaliar a importância da BM V durante o desenvolvimento da retina e como a BM V estaria envolvida em processos apoptóticos. Usando técnicas de imunohistoquímica e Western blot em células retinais normais vimos, preliminarmente, um perfil de distribuição diferenciado em retina.
Este modelo poderá elucidar diversos mecanismos da neurogênese normal e estabelecer paralelos com a morte celular causada por calpaína. Assim como o uso de inibidores de protease para o tratamento de lesões induzidas por isquemia, similar ao já conhecido para fodrina (Wang e Yuen, 1994)
 

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Numa colaboração recentemente iniciada entre o Laboratório de Bioquímica de Proteínas, a Unidade de Nutrição Clínica e o Laboratório de Biofísica Química de Proteínas do Dr. Sergio Ferreira, estamos iniciando a investigação dos mecanismos de ação de proteínas no tratamento da diarréia. Participam neste projeto as alunas de pós-graduação Daniela Vuvovix e Ana Cristina
 

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Em conjunto com a Dr. Carmen Lucia Antão Paiva, Andre Grossi e Roberto Mello estamos estabelecendo técnicas de imobilização de proteínas em suportes amínicos para a purificação de BM V.
 

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