DNA ligase is recruited to sites of DNA replication by an interaction with proliferating cell nuclear antigen: identification of a common targeting mechanism for the assembly of replication factories

 

EMBO J 1998 Jul 1;17(13):3786-95

Montecucco A, Rossi R, Levin DS, Gary R, Park MS, Motycka TA, Ciarrocchi G, Villa A, Biamonti G, Tomkinson AE

 

Introdução

 

Na ultima década foi demonstrado que a replicação em mamíferos e em bacteriófagos é feita por uma maquinaria multiproteica. E que esse processo ocorre em determinados locais da matriz nuclear, que se formam em determinada fase do ciclo celular.

O vírus SV40 é de extrema importância para o estudo da enzimologia da replicação de mamíferos in vitro na presença de antigeno T, o que possibilitou a purificação de várias proteínas envolvidas na replicação como: a proteína de replicação A (RP-A), O fator de replicação C (RF-C), o antigeno de núcleo celular em proliferação (PCNA), DNA polimerase d, DNA polimerase a/primase, RNase H, FEN-1 e DNA ligase I.

A síntese da fita líder do DNA é iniciada pela DNA polimerase a/primase e é estendida pela DNA polimerase d, na fita retardatária há a formação dos fragmentos de Okasaki, o fragmento de RNA é retirado pela DNA polimerase a/primase e também é estendido pela DNA polimerase d. Na síntese das duas fitas há a participação do PCNA.

O Envolvimento do PCNA com a síntese da fita líder e retardatária e sua interação com RF-C, DNA polimerase d, FEN-1 e DNA ligase I sugere que PCNA tem um papel central em coordenar a síntese de DNA.

Foi proposto baseado em estudos com células proliferativas incubadas com BrdU que no final da Fase G1 e início da fase S as proteínas são reunidas em fábricas de replicação, que são mantidas em sua localização por se ligar com a matriz nuclear.

Para que o modelo descrito acima realmente ocorra é necessário que as proteínas de replicação contenham um seqüência que as guie para as fábricas de replicação. Segundo estudos anteriores indicaram que regiões da DNA ligase I media o recrutamento dessa enzima para as fabricas, alem disso foi demonstrado que fragmentos dessa enzima podem se ligar a PCNA.

Nesse artigo é apresentado a seqüência de aminoácidos necessária para a interação da DNA ligase I com PCNA, e que essa interação faz com que essa enzima se dirija para as fabricas de replicação.

 

Resultados

 

A DNA Ligase I é composta por um domínio catalítico C-terminal (217-919) e um domínio N-terminal que não é necessário para sua atividade in vitro mas é essencial para sua função in vivo. Com o uso de uma série de mutantes com deleções foi determinada a seqüência necessária para a interação da DNA ligase I com as fábricas de replicação.

O sinal de localização nuclear (NLS) que é necessário para o transporte ativo para o núcleo está localizado nos resíduos de 119-131 da DNA ligase I.

A seqüência de 11 aminoácidos da região N-terminal são suficientes para levar a DNA ligase I para as fábricas de replicação no núcleo. Mas somente esses 11 aminoácidos ligados a proteína fluorescente verde (GFP), que pode entra passivamente no núcleo, não leva às fabricas de replicação. Já com os 20 primeiros aminoácidos ligados a GFP há um direcionamento para as fábricas de replicação.

Dessa forma parece que as cargas positivas do NLS substituem os aminoácidos de 12-20 da DNA ligase I, assim a sequência de 1-11 mais NLS ligada a GFP pode-se co-localizar com as fábricas. E com a utilização de anticorpos monoclonais provou-se que PCNA esta co-localizada com as fabricas durante a fase S.

Baseado nesses resultados os autores sugerem que a RFTS da DNA ligase I está situada em duas regiões distintas: BOX-1 que com os resíduos de 1-11 com aminoácido hidrofóbicos e a BOX-2 com os resíduos de 12-20 rica em aminoácido positivo.

 

Outra proteínas como RF-C possuem seqüências homólogas com o RFTS da DNA ligase I.

A BOX-2 do RFTS pode ser substituída por PKKKRTV demonstrando que aminoácidos carregados positivamente são necessários para a associação com as fábricas.

A BOX-1 do RFTS da DNA ligase I e do RF-C apresentam a seqüência IxxFF muito conservada o que indica que essa região é muito importante para a sua função. A deleção ou a substituição desses aminoácidos por outros demonstrou que eles são essenciais para o direcionamento para as fábricas de replicação.

Já se sabia em estudos anteriores que a DNA ligase I se liga ao PCNA e essa ligação é feita por aminóacidos da região N-terminal.

Foi demonstrado nesse trabalho através da técnica de Pull Down que PCNA se liga a GST que contem os resíduos de 1-19 da DNA ligase I, os resíduos de 20-118 parecem não contribuir para a ligação com PCNA.

Já a seqüência N-terminal com os resíduos 8e 9 substituídos por alaninas não se ligou ao PCNA demonstrando que esses aminoácidos são essenciais para a interação.

Testes com GST-RF-C1-16 demonstrou que essa região da RF-C também se liga ao PCNA.

Também por experimentos de pull down se demonstrou que a BOX-1 é essencial para a ligação especifica com PCNA e a BOX-2 estabiliza ou aumenta a especificidade da ligação.

Através desse resultados os autores sugerem que a associação estável da DNA ligase I e do RF-C com as fábricas se da via interação com PCNA.

 

Discussão

 

Foi demonstrado nesse artigo pela construção de uma série de mutantes com seqüências deletadas, que os primeiros aminoácidos da região não catalítica da DNA ligase I é necessária para associação com as fábricas.

Uma seqüência homóloga a RFTS da DNA ligase I foi encontrada também na RF-C outra proteína essencial para a replicação. Esse RFTS é bem conservado em vários eucariotos indicando uma grande importância para o direcionamento subnuclear.

Os autores sugerem que PCNA se liga à região N-terminal da RF-C p140 assim recrutando também RF-C para as fábricas de replicação, e de acordo com outro trabalhos há outras regiões nas subunidades menores que interagem com PCNA em seqüências diferentes diferentes do RFTS N-terminal.

Durante a replicação do DNA,PCNA interage com DNA ligase I, FEN-1, DNA polimerase d e talvez DNA polimerase e, e alem disso pode interagir com XPG, uma nuclease envolvida no reparo por excisão de nucleotídeo, MCMT que metila a fita de DNA recém sintetizada e p21 um inibidor da cdk cinase e da replicação do DNA. As regiões dessas proteínas que interagem com PCNA apresentam homologia com o RFTS da DNA ligase I e do RF-C. Pelo estudo das seqüências dessas proteínas provou-se que o motivo RFTS/PCNA não precisa estar localizado na região N-terminal do peptídeo. Pelo estudo da seqüência homologa com o RFTS da p21 os autores especulam que a inibição do ciclo celular por esse peptídeo pode ser devido a sua ligação a PCNA e impedir que o PCNA se ligue a FEN-1, XPG, MCMT e DNA ligase I.

Como um grande número de proteínas nucleicas se ligam ao PCNA, ele deve estar em excesso molar no núcleo celular.

Se PCNA recruta proteínas para as fábricas de replicação parece contrastante ele se ligar a XPG que é usado para o reparo de DNA, mas parece que uma região de XPG não necessária para a ligação com PCNA é responsável pela distribuição desse peptídeo quando a célula recebe luz UV.

Concluindo, parece que PCNA possui um papel principal no recrutamento de proteínas para as fábricas de replicação, mas uma pergunta não foi respondida, o que leva PCNA para as fábricas de replicação.