Linker Histone H1 Regulates

Specific Gene Expression

but not Global Transcription In Vivo

Xuetong Shen and Martin A. Gorovsky

Departament of Biology

University of Rochester

Rochester, New York 14627

No núcleo eucariótico, o DNA é altamente compactado dentro de um complexo núcleo-protéico referido como cromatina que permite uma transcrição regulada; sendo que uma transcrição regulada requer ativação de genes tão bem quanto a repressão.

O nível mais fundamental da organização da cromatina é uma unidade periódica e particulada, o nucleossomo, com uma extensão repetida de aproximadamente 200 bp de DNA.

No nucleossomo, o DNA dá duas voltas(aproximadamente 80 pb por volta) ao redor do centro octamêrico contendo duas das quatro histonas centrais, a H2A, H2B, H3 e H4. Este core é separado por uma variável extensão de DNA, o linker. Associada ao linker, há uma histona menos conservada, a H1.

A histona H1 localiza-se na entrada e na saída do DNA do nucleossomo. Utiliza uma parte do linker, completando as duas voltas no nucleossomo. Parece que a H1, de regiões ativas de transcrição, está parcialmente desligada.

Neste trabalho, o nocaute de H1 foi realizado em Tetrahymena themophila para observar o efeito na transcrição. Este protozoário contém dois núcleos: o macronúcleo, ativo no desenvolvimento vegetativo, possui H1 típica, codificada pelo gene HHO; e o micronúcleo, que é inerte na fase vegetativa. Neste micronúcleo, o linker tem associação com 4 proteínas(a b , g e d ) que formam um complexo referido como MIcLH codificadas pelo MLH.

Em um primeiro experimento, o peso seco de células nocauteadas(D H1 e D MicLH) não foi alterado. O RNA total foi isolado e medido por espectofotometria, obtendo valores maiores do que 1,8; indicando que o RNA está puro(sem proteína).

Para observar o efeito da RNA polI, o total de RNA de 10.000 células foi separado em um gel de agarose-formaldeído e corado com brometo de etídio. Uma única banda de rRNA, contendo 17S rRNA e duas metades juntas de 26S rRNA, é observada. Usando uma sonda para 26S rRNA em Northern blot, pequenas diferenças foram detectadas entre os tipos selvagem, D H1, D MicLH e D D LH. Portanto, transcritos de RNA polI não são afetados em células com deficiência em histonas do linker.

O mesmo procedimento foi realizado para testar o efeito da RNA polIII, porém, a partir de 200.000 células/ml durante a fase de crescimento. Usando uma sonda específica para 5S rRNA e para Gln-tta, pequenas difernças foram detectadas. Logo, dois específicos transcritos pela RNA polIII não são afetados em células nocauteadas para histonas do linker.

Assim como foi realizado o experimento para RNA polIII, pequenas diferenças foram observadas usando uma sonda polyT para detectar transcritos poly A+, e, consequentemente, o efeito na transcrição pela RNA polII.

O RUN-ON, teste em que a meia vida do mRNA não é considerada, foi realizado para testar se a transcrição aumenta e se a meia vida do mRNA diminui na mesma proporção.

O próximo procedimento foi examinar genes indutíveis através de análises de Northern blot e RUN-ON.

O gene ngoA, testado, pode ser detectado em células carenciads, mas não em células em crescimento. Após o nocaute, células carenciadas continuaram tendo uma alta expressão deste gene e as células em crescimento passaram a apresentar um nível basal de expressão quando o nocaute foi D H1 e D D LH. No controle e no D MicLH, não houve expressão do ngoA. Portanto, a histona H1 pode funcionar como um repressor específico in vivo.

A CyP(cisteína protease), como a ngoA, é induzida em células carenciadas e reprimida em células em crescimento, mas não por H1. O gene CyP diminui transcrição e a histona H1 pode funcionar como ativadora deste gene na transcrição in vivo.

Concluindo, não há efeitos globais na transcrição. A taxa de transcrição para RNA polI, RNA polII e RNA polIII é a mesma para as células tipo selvagem e as células nocauteadas. As histonas do Linker podem participar de repressão e ativação.